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即用型ECM試劑盒(小鼠IgG)

顯色試劑盒

分類:

免疫印跡檢測系統 - 蛋白檢測

說明書:

AR1187

398元/Kit  

WB

WB輔助試劑

現貨

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Product Brief

  • 產品概況

    產品貨號AR1187(適于一抗為小鼠IgG 的Western Blotting 檢測)
    價格規格¥398/盒
    工作原理

        蛋白質的電泳分離是重要的生物化學分離純化技術之一, 電泳是指帶電粒子在電場作用下 , 向著與其電荷相反的電極移動的現象。根據所采用的支持物不同,可分為:瓊脂糖凝膠電泳、淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。其中以聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)最廣泛。它的優點為:無電滲作用,樣品用量少(1-100μg),分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機械強度大,重復性好以及可以通過調節單體濃度或單體與交聯劑的比例而得到孔徑不同的凝膠。SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質的電泳方式,它根據蛋白分子大小不同,遷移速率的不同而達到分離目的,特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量。

        免疫印跡是將凝膠電泳的高分辨力和免疫化學檢測的特異性融為一體。免疫印跡技術首先借助凝膠電泳將蛋白質抗原分離,然后將凝膠中的蛋白質轉印到膜上使之成為被分離的一個拷貝。免疫印跡為檢測樣品中是否存在目的蛋白提供一種可靠的方法,該法鑒定蛋白質的原理是根據被測蛋白能與特異性抗體結合的特性并通過相對遷移率來體現該蛋白的分子量。如果想要了解樣品中是否存在某一抗原,以及該抗原的含量或該抗原多肽鏈的相對分子質量以及亞型,是否與其他蛋白結合,蛋白質的酪氨酸殘基是否發生磷酸化等有關問題均可采用免疫印跡。

        免疫印跡包括多個簡單步驟,可在一到兩天完成,該方法具有高效,簡便,靈敏等特點。
    保存條件4℃
    有效期一年
    試劑盒的內容

    1.封閉試劑:10g蛋白質干粉(脫脂奶粉)

    2. HRP標記羊抗小鼠 IgG:0.1ml(親和純化抗體,經過人血清吸附以去除交叉抗體,按照1:2000-10000稀釋)

    3. 即用型ECM顯色劑: A液50ml  B液50ml


Instructions

實驗操作步驟:

1.蛋白質的樣品制備:

a.細胞樣品的制備:

1.胰酶消化后裂解:細胞培養至80%左右密度時,以含0.25%胰蛋白酶消化,低速離心,棄上清。細胞經預冷的PBS漂洗3次,加入裂解液(根據細胞數量定)反復吹打。

2.皿上直接裂解: 細胞培養至80%左右密度時,細胞經預冷的PBS漂洗3次,加入裂解液(根據細胞數量定),轉移至離心管中,反復吹打。

b.組織樣品的制備: 新鮮組織塊迅速置于預冷的生理鹽水中,漂洗數次,按組織凈重:裂解液=1:10的比例,加入相應體積的裂解液進行勻漿,離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理)

c.蛋白變性:處理后的樣品加入樣品緩沖液混勻,樣品置1000C的水浴箱加熱3-5分鐘,10000g離心10分鐘,取上清液。(樣品可立即使用也可以分裝凍存,-20℃可穩定保持數月。)

2.SDS-PAGE電泳:

a.制膠:

1.按比例配制分離膠(丙烯酰胺母液:單體:雙體=29:1),緩緩地搖動溶液,使激活劑混合均勻,將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中,再在液面上小心注入一層水或正丁醇,以阻止氧氣進入凝膠溶液中,37℃恒溫箱中靜置60min。

2.同前按比例配制濃縮膠,但混勻溶液時不要過于劇烈以免引入過多的氧氣。吸去不連續系統中下層分離膠上的水分,以連續平穩的液流注入凝膠溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡,37℃恒溫箱中靜置60min以上以保證完全聚合。

b.加樣:依次加入標準品和待分析樣品。(加樣時間要盡量短,以免樣品擴散,可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應。樣品一般在1.0mm厚的膠 加樣50-100ug/lane)。

c.電泳:  加樣完畢,選擇適當的電壓進行電泳即可。一般采用恒壓濃縮膠55V,分離膠75V,電泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處,即停止電泳。

3.轉膜:

蛋白質經SDS-PAGE分離后,從凝膠中轉移到固相支持物上,常用的支持物有:硝酸纖維膜即NC膜或PVDF膜。電泳結束后,取出凝膠,在轉印緩沖液中漂洗數秒。蛋白質從凝膠向膜轉移的過程普遍采用電轉印法,包括濕式電轉印和干式電轉印。

a干式電轉印: 將轉印槽陰極平放工作臺上,并在上面加三張電轉印液浸透的1mm厚的濾紙,將電轉印液浸透0.45μm的N.C膜放在濾紙上,再將凝膠平放在N.C膜上,最后在凝膠上加蓋三層電轉印液浸透1mm厚的濾紙,電流根據凝膠面積按1-2 mA/cm2, 接通電源,經1-1.5小時電轉印。                                                                              

b濕式電轉印: 打開電轉印夾,每側墊上一塊專用的用轉印液浸泡透的海面墊,再各放三塊轉印液浸透的濾紙,濾紙與海面墊大小相同或與NC膜、凝膠大小相同均可,將凝膠平放在陰極側濾紙上,最后將NC膜平放在凝膠上,按照(-) 夾板-海棉-濾紙-膠塊-NC膜-濾紙-海綿-夾板 (+)裝好,依次除盡每層間氣泡,夾好電轉印夾。 電泳槽加滿預冷電轉印液,插入電轉印夾,將電泳槽放入冰箱內,連接好電極,接通電流,轉印夾的NC膜應對電泳槽的正極,  4℃ 250-300mA, 轉印80min(根據分子量不同,轉印時間可適當調整)。

4.膜的封閉: 

TBS-T洗膜3次,每次10min, 以盡量洗去轉印膜上的SDS (以免影響抗體的結合),加入適量的封閉液,搖床搖動,室溫封閉2h或4℃過夜。

封閉液配置:TBS溶液中加入5%的脫脂奶粉。

5.抗體雜交:

a封閉后的雜交膜放入雜交袋中,加入稀釋的一抗,4℃孵育過夜或37℃兩小時,TBS-T洗膜3次,每次10min。(一抗的稀釋度,孵育時間,溫度與顯色強度,背景有直接關系。一般來說,陽性不強時可提高一抗濃度和延長孵育時間,而背景高,非特異性條帶多,則降低抗體濃度和孵育時間)。

b加入稀釋的HRP標記羊抗小鼠IgG, 37℃孵育1.5小時或4℃過夜,TBS-T洗膜3次,每次10min。

一抗二抗稀釋液配置:TBS溶液中加入5%的脫脂奶粉。

6.顯色(ECM)

ECM顯色劑配制:顯色劑A和顯色劑B按1:1的比例混合。將雜交后印跡膜放入顯色盒中,加上適量的混合好的顯色液反應約1-5分鐘。吸去印跡膜邊緣顯色液,將一透明的玻璃紙蓋住撫平,以確保X感光膠片的干燥。印跡膜轉入暗室中使膠片曝光30秒-5分鐘。將曝光后的X感光膠片放入顯影液中至膠片上出現條帶,再放入定影液中定影,膠片可長期保存。

熒光成像儀(CCD)檢測:將印跡膜放置到熒光成像儀內,按儀器說明書進行檢測和記錄化學發光圖像。

附錄:

1:對照的設置  內參: 提示系統的穩定性,一般是一些管家蛋白; 陽性對照:即肯定可以表達目的蛋白的組織或者細胞,同時可以提示你一抗的質量; 陰性對照: 即肯定不會表達目的蛋白的組織或者細胞。



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